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免疫細胞(ICC)實驗常見問題有哪些?

 發布時間:2023-10-20 點擊量:74

免疫細胞化學 (ICC) 是一種使用熒光抗體或染料來檢測細胞內靶抗原的技術。那么免疫細胞(ICC)實驗常見問題有哪些?讓我們一起來看看吧!

一、熒光信號弱

1. 樣品質量

選用新鮮制備的樣本以及適當的保持條件。

2. 靶標豐度低

適當提高一抗濃度。

選擇熒光強度更強的二抗。

3. 固定方法不當

甲醛和蛋白的氨基通過共價鍵結合,可能會遮蓋抗原表位,導致靶表位信號減弱。建議調整抗原修復方法或固定方法。

多聚甲醛會與GFP熒光蛋白發生醛化反應,導致信號減弱。

檢測膜蛋白一般不建議使用甲醇或丙酮固定,有機溶劑能夠破壞膜結構。

4. 透化方法不當

檢查靶標蛋白表達位置,胞內蛋白需要透化處理。

膜蛋白需要考慮所檢測靶表位位于膜內還是膜外,膜外則不需要透化。

5. 信號放大不夠

如果檢測靶點是低豐度蛋白.信號弱可能是由于信號放大不足導致的,可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信號放大技術,進一步增強信號,實現低豐度,難以檢測蛋白的檢測。

二、背景太高

1. 封閉不足

1)選用二抗種屬來源的血清封閉。

2)選用鏈霉親和素/生物素系統,需要用鏈霉親和素封閉內源的生物鏈酶。

3)選用HRP系統,需要使用過氧化氫等商業化試劑盒去活化內源性HRP。

4)選用AP系統,需要使用左旋咪唑等商業化試劑去活化內源性磷酸酶。

2. 一抗

一抗濃度過高,減少用量

3. 二抗

1)設置無一抗對照,幫助確認背景是否來源二抗。

2)二抗濃度過高,減少用量。

3)抗體凝聚,使用二抗前離心去掉抗體凝聚物。

4)使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗,信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。

4. 自發熒光

1)設置自發熒光對照,確定是否自發熒光。

2)固定劑如醛類和氨基共價結合導致的自發熒光,可用硼氫化na去除。

3)增加固定劑的漂洗次數。

4)避開背景高的波段,選用背景較低的波段檢測。

更多有關免疫細胞(ICC)實驗常見問題,請聯系北京百奧創新科技有限公司:


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